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稀釋水的質量對BOD5測定結果的準確性具有重要意義。因此，要求稀釋水空白5天的耗氧量必須小于0.2mg/L，最好小于0.1mg/L，接種后的稀釋水5日耗氧量應在0.3～1.0mg/L之間。 保證稀釋水水質的關鍵是控制有機物的最低含量和抑制微生物繁殖的物質的最低含量，因此，最好用蒸餾水作為稀釋水，不宜用離子交換樹脂制成的純水作為稀釋水，因為去離子水往往含有從樹脂中分離出來的有機物。如果制備蒸餾水的自來水中含有一些揮發性有機化合物，為防止它們殘留在蒸餾水中，蒸餾前應進行預處理以去除有機化合物。在金屬蒸餾器制備的蒸餾水中，應注意檢查其中金屬離子的含量，以免發生抑制微生物的繁殖和代謝的情況，影響BOD5測定結果的準確性。 如果使用的稀釋水因有機物不符合要求，可加入適量曝氣池接種液后，在室溫或20℃條件下保存一定時間，即可消除。接種量以5d耗氧量0.1mg/L左右為原則。為了防止藻類繁殖，必須在暗室中進行儲存。如果儲存后的稀釋水中有沉淀物，只能使用上清液，過濾去除沉淀物。 為保證稀釋水中的溶解氧接近飽和，必要時可用真空泵或水射器吸入凈化空氣，也可用微型空壓機注入凈化空氣， 并且可以用氧氣瓶引入純氧，然后將充氧的稀釋水放入20℃的培養箱中一定時間，讓溶解氧達到平衡。冬季放置在較低室溫的稀釋水可能含有過多的溶解氧，夏季高溫季節則相反。因此，當室溫與20℃有明顯差異時，必須在培養箱中放置一段穩定的時間，使其與培養環境中的氧分壓平衡。
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